摘要：目的 探討激素替代-凍融胚胎移植（HRT-FET）周期子宮內(nèi)膜的最佳容受時間。方法 根據(jù)子宮內(nèi)膜暴露于黃體酮天數(shù)的不同（3、4、5、6和7d），將52例行HRT-FET的患者依次定義為P3組、P4組、P5組、P6組及P7組，分別觀察各組胞飲突形態(tài)及覆蓋面積，并檢測整合素αvβ3、同源框基因A10（HOXA10）及LIF3種蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果 多數(shù)患者在黃體酮補(bǔ)充6d時，其子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育程度與αvβ3、HOX-A10及LIF3種蛋白表達(dá)水平一致性達(dá)到最高。結(jié)論 將胞飲突發(fā)育程度檢測作為凍融胚胎移植時間評估的參考依據(jù)是可行，于黃體酮補(bǔ)充3d時對胚胎進(jìn)行移植，可能是實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜與胚胎同步化的理想選擇。
　　
　　關(guān)鍵詞：激素替代-凍融胚胎移植；子宮內(nèi)膜；容受
　　
　　輔助生殖技術(shù)雖然提高激素替代-凍融胚胎移植（hormone replacement therapy-frozen embryo transfer,HRT-FET）的妊娠率，但是胚胎種植失敗仍時有發(fā)生[1].受雌、孕激素影響，子宮內(nèi)膜發(fā)生形態(tài)改變以利于胚胎黏附與著床，即種植窗。過早或過晚都將導(dǎo)致胚胎種植不接納。種植窗開放于黃體中期，各時間子宮內(nèi)膜容受性取決于胞飲突完全發(fā)育成熟及整合素αvβ3（integrin alpha v beta 3,αvβ3）、同源框基因A10（homebox A10 gene,HOXA10）蛋白和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）[2-3]表達(dá)。關(guān)于黃體酮在HRT周期內(nèi)補(bǔ)充多長時間最有利于胚胎移植，尚未見報道。
　　
　　1資料與方法
　　
　　1.1研究對象
　　
　　選取2015年7月-2015年9月在本院因輸卵管性不孕或男性因素不育而接受輔助生殖技術(shù)治療，并即將行HRT-FET周期的52例女性患者作為研究對象。年齡22~35歲，平均（27.6±3.7）歲。所有納入患者有規(guī)律月經(jīng)周期、正常的基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平，并未使用任何宮內(nèi)節(jié)育器；同時將合并有子宮畸形、排卵障礙、子宮內(nèi)膜異位、盆腔粘連的患者，以及反復(fù)發(fā)生種植失敗的患者排除在外。所有受試者簽署知情同意書，經(jīng)本院倫理委員會同意。
　　
　　1.2實(shí)驗(yàn)方法
　　
　　52例患者接受激素替代治療，自月經(jīng)周期第3天開始連續(xù)7d給予戊酸雌二醇，3mg/次，2次/d,7d后將服藥劑量調(diào)整至4mg/次，連續(xù)服用6d.在患者服藥過程中采用陰道超聲對其子宮內(nèi)膜厚度（2個外強(qiáng)回聲線間的最大距離）進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，若經(jīng)上述給藥后厚度<8mm,再按調(diào)整后的劑量繼續(xù)用藥3d左右；當(dāng)厚度≥8mm后應(yīng)用黃體酮（Proges-terone,P）陰道緩釋凝膠，90mg/d.根據(jù)子宮內(nèi)膜暴露于P的天數(shù)（3、4、5、6和7d）將52例患者全部入組，共5組，依次定義為P3組（9例）、P4組（11例）、P5組（12例）、P6組（11例）及P7組（9例）。各組患者的年齡、不孕年限及子宮內(nèi)膜厚度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。所有患者在P完成給藥的次日采用pipelle內(nèi)膜導(dǎo)管進(jìn)行子宮內(nèi)膜活檢標(biāo)本的采集，取得樣本后立即采用生理鹽水進(jìn)行清洗，隨后將各組樣本分作2份，其中一份采用2.5%戊二醛固定處理后于4℃條件下保存，制成電鏡標(biāo)本后即采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行胞飲突形態(tài)及覆蓋面積的觀察。其中，胞飲突形態(tài)主要依據(jù)其發(fā)育狀態(tài)的分級情況進(jìn)行判定，分為5級，分別為發(fā)育前、發(fā)育中、發(fā)育完全、衰退期及發(fā)育后。覆蓋面積即胞飲突占子宮內(nèi)膜表面面積的百分比，每份樣本隨機(jī)選取10個區(qū)域，放大2000倍進(jìn)行觀察，完全未覆蓋（0%）計(jì)0分，少量覆蓋（≤20%）計(jì)1分，中等覆蓋（21~50%）計(jì)2分，大量覆蓋（>50%）計(jì)3分，最后計(jì)算每份樣本的平均得分。另一份在清洗后立即用液態(tài)氮冷凍，并放置于-80℃冰箱冷凍儲存待檢，參考文獻(xiàn)[4]完成蛋白樣品制備，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，采用Westernblot檢測αvβ3、HOXA10及LIF3種蛋白的相對表達(dá)量。見圖1.
　　 　　
　　1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　
　　數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用SNK-檢驗(yàn)，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　
　　2結(jié)果
　　
　　2.1 5組子宮內(nèi)膜標(biāo)本的胞飲突形態(tài)分級
　　
　　P3組與P4組基本全處于發(fā)育前或發(fā)育中狀態(tài)，隨著子宮內(nèi)膜暴露于黃體酮時間的延長，處于衰退期和發(fā)育后的例數(shù)逐漸增加，P5組7例（58.3330%）發(fā)育中，4例（33.3330%）完全發(fā)育，1例（8.3333%）衰退期；P6組1例（9.0910%）發(fā)育中，8例（72.7270%）完全發(fā)育，2例（18.1820%）衰退期；P7組1例（11.1110%）完全發(fā)育，5例（55.5560%）衰退期，3例（33.3330%）發(fā)育后。見表1.
　　 　　
　　2.2 5組子宮內(nèi)膜標(biāo)本的胞飲突覆蓋面積評分比較
　　
　　電鏡顯示，P3組、P4組、P5組、P6組及P7組子宮內(nèi)膜標(biāo)本的胞飲突覆蓋面積評分分別為（0.88±0.09）、（0.97±0.11）、（2.38±0.16）、（2.74±0.15）和（2.41±0.14），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=439.230,=0.000），胞飲突在子宮內(nèi)膜表面達(dá)大量覆蓋程度只存在于P5組、P6組及P7組中；P5組、P6組、P7組與P3組和P4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.000），P6組與P5組、P7組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.000），P5組與P7組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05）。
　　
　　2.3 5組子宮內(nèi)膜αvβ3、HOXA10及LIF3種蛋白的表達(dá)水平比較
　　
　　5組子宮內(nèi)膜αvβ3、HOXA10、LIF3種蛋白的表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=40.142、30.423和11.883,=0.000）；P6組3種蛋白的相對表達(dá)量最高（<0.05）。見表2和圖2.
　　 　　 　　
　　3討論
　　
　　就當(dāng)前體外受精-胚胎移植在臨床開展的情況來看，F(xiàn)ET愈發(fā)變得常規(guī)化，但某些環(huán)節(jié)仍需進(jìn)一步完善。在自然周期中，成熟的子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育存在良好地同步性，這是確保其在接觸時均能處于最理想狀態(tài)的生理性基礎(chǔ)。HRT-FET周期則往往不具備這樣的條件，目前關(guān)于在FET前最佳的黃體酮持續(xù)給予時同尚未達(dá)成共識。在HRT周期中，如果子宮內(nèi)膜與胚胎未能較好同步，則可能發(fā)生種植窗口提前關(guān)閉、種植率降低或胚胎發(fā)育延遲等多種情況。如何更為滿意地實(shí)現(xiàn)同步化是當(dāng)前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向之一[5-6].
　　
　　有研究認(rèn)為，呈完全發(fā)育狀態(tài)胞飲突的大面積出現(xiàn)與消失分別對應(yīng)著種植窗開放與關(guān)閉的兩種狀態(tài)，并建議將胞飲突的該特征作為評估子宮內(nèi)膜容受性及把握種植窗時間的形態(tài)學(xué)標(biāo)志物[7].但新近有個別學(xué)者對該觀點(diǎn)提出質(zhì)疑，尤其在胞飲突持續(xù)時間方面爭議頗大。有研究者認(rèn)為，胞飲突于月經(jīng)周期的黃體中期所持續(xù)的時間<48h[8];另有研究者則提出，胞飲突的一般出現(xiàn)于排卵后的一小段時間內(nèi)，而持續(xù)時間則可能至黃體末期乃至妊娠11周左右[9].基于多方研究存在較大的不一致性，故有學(xué)者得出通過胞飲突并不能對人類種植窗做出精確描述的結(jié)論。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)偶爾也能在P3與P4組中觀察到呈完全發(fā)育狀態(tài)的胞飲突，雖然非常少量，但是由此推測，在黃體酮補(bǔ)充第8天內(nèi)同樣也可能存在少量的呈完全發(fā)育狀態(tài)的胞飲突。其原因可能為子宮內(nèi)膜胞飲突實(shí)為發(fā)育后的微絨毛細(xì)胞，且該發(fā)育過程受孕激素調(diào)節(jié)[10-12].而在持續(xù)高水平孕激素的環(huán)境條件下，微絨毛細(xì)胞可能會表現(xiàn)有一個動態(tài)的變化周期，即微絨毛細(xì)胞→發(fā)育中胞飲突→完全發(fā)育胞飲突→衰退期胞飲突→微絨毛細(xì)胞。同時本研究中，P6組有8例（72.7%）處于完全發(fā)育狀態(tài)，且該組胞飲突覆蓋面積評分也最高。故推斷盡管胞飲突會以較少數(shù)量的形式零散存在于其他黃體期時間，但呈完全發(fā)育狀態(tài)胞飲突的數(shù)量可在某一時間達(dá)峰值，該時間可能為最佳容受性時間點(diǎn)。因此，或許除對胞飲突持續(xù)時間進(jìn)行評估外，考察成熟胞飲突的數(shù)量也非常重要。
　　
　　不同個體其成熟胞飲突數(shù)量達(dá)峰值的時間不完全相同。以28d為常規(guī)周期，正常情況下的峰值出現(xiàn)時間為19~21d（參照本研究為P5~P7），而大多數(shù)不孕女性則為第20天。在卵巢刺激周期，正常峰值時間為18~22d,而大多數(shù)不孕女性則為第19天（第14天排卵），亦即是說較自然周期提前1~2d.在HRT周期中，不同女性峰值時間通常為周期第20~22天（參照本研究為P6~P8），黃體酮首次補(bǔ)充時間（即本研究的P1）為第15天。但未接受卵巢抑制治療患者其胞飲突出現(xiàn)的時間變化為P6~P10[13].激素的應(yīng)用及患者個體差異可能是導(dǎo)致峰值時間不同的重要原因[14].在本研究中，多數(shù)患者在黃體酮補(bǔ)充第5天開始有觀察到胞飲突形成，在P6日達(dá)峰值，P7日開始衰退，而P5~P7對應(yīng)自然周期的19~21d,該結(jié)果提示本研究方案中成熟胞飲突的形成時間與自然周期相似。
　　
　　另一方面，本研究還發(fā)現(xiàn)一個非常有趣的現(xiàn)象，即是αvβ3、HOXA10及LIF3種子宮內(nèi)膜容受性分子標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平同樣也在黃體酮補(bǔ)充6d時達(dá)最高，這與胞飲突在HRT周期中的發(fā)育情況一致。該結(jié)果提示，αvβ3、HOXA10及LIF可能與胞飲突潛存著某種關(guān)聯(lián)，并通過一定的相互作用來共同影響子宮內(nèi)膜容受性[15-16].同時在本研究所開展的HRT方案中，黃體酮補(bǔ)充6d子宮內(nèi)膜具最佳容受性的時間點(diǎn)。然而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)第3天體外凍融胚胎的發(fā)育情況及HRT周期方案，于黃體酮補(bǔ)充3d時對第3天胚胎進(jìn)行移植，胚泡植入正好發(fā)生在胞飲突呈完全發(fā)育狀態(tài)的時間[17].故就本研究所實(shí)施的HRT方案而言，多數(shù)患者的最佳移植時間應(yīng)該在黃體酮剛好補(bǔ)充3d.根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對種植反復(fù)失敗的患者，可以進(jìn)行HRT周期模擬，于P5或P6后采集內(nèi)膜樣本，如樣本顯示絕大多數(shù)（>50%）的胞飲突呈完全發(fā)育狀態(tài)，那么當(dāng)天即為是最佳容受時間，即當(dāng)天可移植。如樣本顯示胞飲突呈發(fā)展中狀態(tài)或衰退期狀態(tài)，則將最佳容受時間對應(yīng)延遲或提前1d,即延遲1d移植或下一周期再行移植。
　　
　　綜上所述，鑒于在本研究所開展的HRT方案中，多數(shù)患者于黃體酮補(bǔ)充6d時，其子宮內(nèi)膜胞飲突發(fā)育程度與αvβ3、HOXA10及LIF3種子宮內(nèi)膜容受性分子標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平一致性達(dá)最高，故從操作便捷性角度出發(fā)，將胞飲突發(fā)育程度檢測作為FET時間評估的參考依據(jù)是可行的，同時在本研究HRT-FET周期中，于黃體酮補(bǔ)充3d時對胚胎進(jìn)行移植可能是實(shí)現(xiàn)同步化的理想選擇。
　　
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