摘要  目的  探討氯化鋰對丙泊酚誘導原代培養皮層神經(jīng)元凋亡的影響及機制。方法  體外原代培養7d的大鼠皮層神經(jīng)元，用MTT法檢測不同濃度氯化鋰（0.1、1、5、10μmol/L）單獨作用皮層神經(jīng)元12h后神經(jīng)元存活率的變化。神經(jīng)元隨機分為6組：溶劑對照組（給予等容積的20%脂肪乳），丙泊酚組（終濃度為500μmol/L），氯化鋰+丙泊酚組（氯化鋰終濃度分別為0.1、1、5、10μmol/L,丙泊酚終濃度為500μmol/L），藥物處理12h后，MTT法檢測神經(jīng)元存活率的變化，Hoechst33258核染色法和流式細胞儀檢測神經(jīng)元調亡，Westernblot法測定神經(jīng)元磷酸化糖原合成酶激酶-3β（pGSK-3β）和裂解半胱天冬酶-3（cleaved-Caspase-3）蛋白水平。結果  與溶劑對照組比較，不同濃度氯化鋰單獨作用神經(jīng)元12h后，神經(jīng)元存活率未見(jiàn)顯著(zhù)變化。與溶劑對照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元存活率顯著(zhù)下降（P<0.01），神經(jīng)元凋亡率顯著(zhù)增加（P<0.01），pGSK-3β蛋白水平顯著(zhù)下降（P<0.01），cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著(zhù)增加（P<0.01）。與丙泊酚組比較，氯化鋰可劑量依賴(lài)性增加神經(jīng)元存活率（P<0.01），神經(jīng)元凋亡率顯著(zhù)下降（P<0.01），pGSK-3β蛋白水平顯著(zhù)增加（P<0.01），cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著(zhù)下降（P<0.01）。結論氯化鋰可抑制丙泊酚誘導的原代培養皮層神經(jīng)元凋亡，其機制可能與提高神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平和降低cleaved-Caspase-3蛋白水平有關(guān)。

　　

　　關(guān)鍵詞  丙泊酚；氯化鋰；神經(jīng)凋亡；原代培養皮層神經(jīng)元；pGSK-3β；cleaved-Caspase-3

　　

　　研究[1-2]表明出生7dSD大鼠連續大劑量應用丙泊酚可引起大腦多個(gè)腦區神經(jīng)細胞的凋亡，并引起大鼠成年后的學(xué)習記憶功能損傷。體外原代培養細胞實(shí)驗也表明丙泊酚可誘導神經(jīng)元凋亡[3-4].氯化鋰作為精神科的常用藥物，在臨床上被廣泛用于治療雙向情感障礙[5].近年來(lái)研究[6-7]表明鋰劑可用于治療中樞神經(jīng)系統損傷和老年退行性疾病，如阿爾茨海默病等。以往有研究[8]表明氯化鋰可對抗麻醉藥氯胺酮和丙泊酚所引起的發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)細胞損傷，但具體機制目前還不清楚，該研究利用原代培養皮層神經(jīng)元，探討氯化鋰對丙泊酚誘導皮層神經(jīng)元凋亡的影響及其可能機制。

　　

　　1材料與方法

　　

　　1.1材料  丙泊酚（propofol,意大利AstraZeneca公司，批號：KW814）；20%脂肪乳（廣州百特公司）；Neurobasal培養液、B27促生長(cháng)劑、DMEM培養液、胎牛血清（美國Gibco公司）；DMSO、MTT、17β雌二醇（美國Sigma公司）；胰蛋白酶和Hoechst33258染料（北京索來(lái)寶公司）；Annexin V-FITC試劑盒（浙江聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；磷酸化糖原合成酶激酶-3β（phospho glycogen synthase kinase-3β，pGSK-3β）和裂解半胱天冬酶-3（cleaved-cysteine protease protein-3,cleaved-Caspase-3）（美國Cell signal Tech-nology公司）。

　　

　　1.2皮層神經(jīng)元原代培養  新生1d內的SD幼鼠取額葉皮質(zhì)，用冷PBS液沖洗，去除腦膜和血管后放入DMEM培養基中剪碎，然后放入37℃水浴鍋內將皮層組織充分消化（0.125%胰蛋白酶）15min,然后將皮層組織移入DMEM培養基中（含10%胎牛血清）終止胰蛋白酶的作用，然后把細胞轉移到含DMEM培養基中（含10%胎牛血清）輕輕吹打制成細胞懸液。用100目鋼絲篩將細胞懸液過(guò)濾，計數后接種于多聚賴(lài)氨酸包被的培養板中，放于5%CO2培養箱37℃恒溫培養24h后，將培養液換成Neurobasal+B27培養基繼續培養，每隔2d半量換液1次。神經(jīng)元體外培養至7d用于實(shí)驗。

　　

　　1.3實(shí)驗分組  觀(guān)察不同濃度氯化鋰對皮層神經(jīng)元存活率的影響，分為4組：溶劑對照組，氯化鋰處理組（終濃度分別為0.1、1、5、10μmol/L）。觀(guān)察氯化鋰對丙泊酚引起皮層神經(jīng)元損傷的影響時(shí)，分為6組：溶劑對照組（給予等容積的20%脂肪乳），丙泊酚組（終濃度為500μmol/L），氯化鋰+丙泊酚不同濃度組（丙泊酚終濃度為500μmol/L,氯化鋰終濃度分別為0.1、1、5、10μmol/L）。

　　

　　1.4MTT法檢測神經(jīng)元存活率  按不同分組將神經(jīng)元給予藥物處理12h,每組設6個(gè)復孔。然后每孔加入10μlMTT液，放入37℃恒溫培養箱中繼續孵育4h,加入DMSO200μl/孔，震蕩5min溶解甲,酶標儀測定570nm處的吸光度值。以對照組平均吸光度值為100%,以各處理組吸光度值與對照組的比值計算細胞存活率。

　　

　　1.5Hoechst33258核染色法測定神經(jīng)元凋亡  體外培養7d的神經(jīng)元，按分組分別給予不同藥物處理12h后，顯微鏡下觀(guān)察神經(jīng)元成長(cháng)情況。然后移去培養液，用冷PBS沖洗神經(jīng)元去除雜質(zhì)和死細胞，每孔加入4%多聚甲醛200μl將細胞固定30min,去除多聚甲醛后，用冷PBS沖洗1次，然后每孔加入Hoechst33258染液1ml處理神經(jīng)元8min后，冷PBS漂洗。在熒光顯微鏡（日本奧林巴斯，型號B×41）下隨機選取5個(gè)視野進(jìn)行計數，計算神經(jīng)元的凋亡率，凋亡率（%）=（凋亡細胞數/細胞總數）×100%.

　　

　　1.6流式細胞儀檢測神經(jīng)元凋亡  體外培養至7d給予不同干預措施處理神經(jīng)元12h后，移去培養液，冷PBS液沖洗神經(jīng)元3次，加入0.125%胰酶，邊消化邊鏡下觀(guān)察，當細胞突起回縮，胞體變圓時(shí)立即加入培養基終止消化。然后輕輕吹打混勻用PBS重懸細胞并計數使每管細胞數目不少于1×109/ml,然后轉移到離心管中，1000r/min離心5min,去除上清液，收集細胞。PBS液沖洗細胞2次，1000r/min離心5min,去除上清液，暗室中加入195μlAnnexinV-FITC結合液輕輕重懸細胞，然后加入10μlPI染色液，輕輕混勻，各組設3個(gè)復孔。用美國B(niǎo)D公司流式細胞儀上機檢測各處理組神經(jīng)元的凋亡率。

　　

　　1.7Westernblot法測定神經(jīng)元pGSK-3β和cleaved-Caspase-3蛋白水平  體外培養至7d給予不同干預措施處理神經(jīng)元12h后，用0.25%胰酶將細胞消化收集后裂解，BCA法測定總蛋白含量。將蛋白加上樣緩沖液煮沸變性，以10%SDS二聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5h分離，經(jīng)過(guò)2h將蛋白轉至PVDF膜，室溫下封閉1h分別加入一抗pGSK-3β和cleaved-Caspase-3抗體（1∶2000稀釋?zhuān)��?℃孵育過(guò)夜，常規洗滌，加入二抗（1∶5000）37℃孵育60min,洗滌，電化學(xué)法發(fā)光顯色，X線(xiàn)片曝光。用凝膠圖像處理系統分析目標條帶與內參照條帶吸光度的比值。實(shí)驗重復3次，設β-actin蛋白為內參。

　　

　　1.8統計學(xué)處理  采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計量資料均用x±s表示，采用單因素方差分析和SNK檢驗進(jìn)行數據分析。

　　

　　2結果

　　2.1不同濃度氯化鋰對皮層神經(jīng)元存活率的影響

　　

　　與溶劑對照組（99.8±6.3）%比較，不同濃度氯化鋰（0.1、1、5、10μmol/L）單獨作用皮層神經(jīng)元12h后，神經(jīng)元存活率分別為（98.8±4.9）%,（99.1±5.2）%,（98.6±6.7）%,（99.2±7.2）%,未見(jiàn)顯著(zhù)性變化（F=2.125,P>0.05）。

　　

　　2.2氯化鋰對丙泊酚誘導皮層神經(jīng)元損傷的影響

　　

　　與溶劑對照組（99.9±7.9）%比較，丙泊酚組神經(jīng)元存活率（57.3±4.5）%顯著(zhù)下降（P<0.01）。不同濃度氯化鋰（0.1、1、5、10μmol/L）處理后，神經(jīng)元存活率分別為（60.2±4.6）%,（70.3±6.1）%,（79.3±6.2）%,（85.7±6.7）%,與丙泊酚組比較，1、5、10μmol/L氯化鋰處理組均顯著(zhù)增加（F=65.095,P<0.01），其中10μmol/L氯化鋰保護作用最好。

　　

　　2.3氯化鋰對丙泊酚誘導皮層神經(jīng)元凋亡的影響

　　

　　Hoechst33258核染色法檢測神經(jīng)元凋亡，結果顯示：與溶劑對照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元凋亡率顯著(zhù)增加（P<0.01）。與丙泊酚組比較，氯化鋰+丙泊酚組神經(jīng)元凋亡率顯著(zhù)下降（F=34.636,P<0.01）。見(jiàn)圖1.流式細胞術(shù)檢測結果進(jìn)一步證實(shí)了氯化鋰抑制丙泊酚誘導皮層神經(jīng)元凋亡。見(jiàn)圖2.

　　

　　

　　

　　

　　

　　2.4不同處理對皮層神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平的影響

　　

　　與溶劑對照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平顯著(zhù)降低（P<0.01）。與丙泊酚組比較，氯化鋰+丙泊酚組神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平顯著(zhù)增加（F=98.546,P<0.01）。見(jiàn)圖3.

　　

　　

　　

　　2.5不同處理對皮層神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白水平的影響

　　

　　與溶劑對照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著(zhù)增加（P<0.01）。與丙泊酚組比較，氯化鋰+丙泊酚組神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著(zhù)下降（F=76.329,P<0.01）。見(jiàn)圖4.

　　

　　

　　

　　3討論

　　

　　丙泊酚是否適用于新生兒和嬰幼兒的全身麻醉，目前觀(guān)點(diǎn)不一。研究[1-4]表明丙泊酚具有發(fā)育期神經(jīng)毒性，大劑量長(cháng)時(shí)間應用可對發(fā)育期動(dòng)物大腦廣泛腦區神經(jīng)細胞和原代培養神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡樣損傷，因此丙泊酚對嬰幼兒大腦產(chǎn)生損傷的機制以及尋找藥物防治其損傷引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。

　　

　　動(dòng)物試驗研究[8]表明氯化鋰可抑制丙泊酚引起的發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)細胞凋亡，但作用機制還不十分清楚。為進(jìn)一步研究氯化鋰抑制丙泊酚引起的發(fā)育期大腦損傷的機制，本實(shí)驗應用原代培養皮層神經(jīng)元，顯示氯化鋰可通過(guò)提高神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平和降低cleaved-Caspase-3蛋白水平進(jìn)而抑制丙泊酚誘導原代培養皮層神經(jīng)元凋亡。

　　

　　研究[9-11]表明以GSK-3β為中心的信號通路在麻醉藥誘導發(fā)育期大腦神經(jīng)損傷中發(fā)揮著(zhù)重要作用。GSK-3β在大腦分布廣泛，主要定位于神經(jīng)元樣細胞，是細胞內多種信號轉導通路的重要組成部分，其活化與神經(jīng)元的凋亡直接相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統中，GSK-3β通過(guò)激活轉錄調節細胞的增殖、分化、存活與凋亡，參與神經(jīng)系統的多種病理生理過(guò)程，GSK-3β活性異常會(huì )引起下游信號通路的異常，進(jìn)而引起許多中樞神經(jīng)系統疾病的發(fā)生[12].以往研究[11]顯示丙泊酚可降低發(fā)育期大鼠大腦pGSK-3β蛋白的表達水平，進(jìn)而引起大鼠大腦廣泛腦區神經(jīng)細胞的凋亡。細胞凋亡是麻醉藥引起發(fā)育期大腦神經(jīng)損傷的主要機制之一。凋亡受凋亡調節基因的控制，Bcl-2是調控凋亡的主要基因，可抑制凋亡過(guò)程中起重要作用的因子如Caspase-3和Caspase-9的活化。Caspase-3是凋亡發(fā)生的最終執行者，是凋亡蛋白級聯(lián)反應的必經(jīng)之路，隨著(zhù)Caspase-3蛋白的活化，細胞將發(fā)生不可逆性凋亡。GSK-3β誘導Caspase-3活化可能是引起凋亡的重要機制。本研究結果表明丙泊酚作用皮層神經(jīng)元12h,降低了神經(jīng)元GSK-3βSer9位點(diǎn)的磷酸化水平，引起神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平的顯著(zhù)性下降，同時(shí)使cleaved-Caspase-3蛋白表達水平顯著(zhù)性增加，提示丙泊酚誘導皮層神經(jīng)元凋亡可能與pGSK-3β蛋白水平下降和cleaved-Caspase-3蛋白水平增加有關(guān)。

　　

　　與促凋亡作用相反，抑制GSK-3β活性提高pG-SK-3β蛋白表達水平產(chǎn)生抗凋亡作用，對細胞存活發(fā)揮著(zhù)重要作用。氯化鋰作為一種GSK-3β活性抑制劑，具有廣泛的生物學(xué)效應，在精神障礙性疾病的治療中發(fā)揮著(zhù)重要作用。近年來(lái)氯化鋰的神經(jīng)保護作用受到廣泛重視。研究[13]表明氯化鋰通過(guò)抑制神經(jīng)細胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用，可治療腦缺血和慢性神經(jīng)退行性病變。另有研究[14]表明氯化鋰可抑制新生鼠缺血缺氧引起的大腦神經(jīng)細胞凋亡。本研究進(jìn)一步觀(guān)察氯化鋰對丙泊酚誘導皮層神經(jīng)元損傷的影響，結果表明不同濃度氯化鋰單獨作用皮層神經(jīng)元12h未發(fā)現對皮層神經(jīng)元存活率產(chǎn)生影響，但可抑制丙泊酚引起的皮層神經(jīng)元損傷，表現為神經(jīng)元存活率顯著(zhù)增加和神經(jīng)元凋亡率顯著(zhù)下降。同時(shí)結果表明氯化鋰可通過(guò)抑制丙泊酚引起的神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平下降，降低cleaved-Caspase-3蛋白水平，抑制丙泊酚誘導的皮層神經(jīng)元凋亡，對神經(jīng)元產(chǎn)生保護作用。

　　

　　綜上所述，氯化鋰具有抑制丙泊酚誘導皮層神經(jīng)元凋亡的作用，其機制可能是通過(guò)提高神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平和降低cleaved-Caspase-3蛋白水平實(shí)現的。本研究為圍術(shù)期應用氯化鋰預防丙泊酚對嬰幼兒大腦產(chǎn)生神經(jīng)損傷提供了初步的實(shí)驗依據。

　　

　　參考文獻

　　

　　[1]Huang J,Jing S,Chen X,et al.Propofol administration during early postnatal life suppresses hippocampal neurogenesis[J].Mol Neurobiol,2016,53（2）：1031-44.

　　[2]Karen T,Schlager G W,Bendix I,et al.Effect of propofol in the immature rat brain on short-and long-term neurodevelopmental out-come[J].PLoS One,2013,8（5）：e64480.

　　[3]Zhong Y,Liang Y,Chen J,et al.Propofol inhibits proliferation  and induces neuroapoptosis of hippocampal neurons in vitro via downregulation of NF-κB p65 and Bcl-2 and upregulation of caspase-3[J].Cell Biochem Funct,2014,32（8）：720-9.

　　[4]Berns M,Seeberg L,Schmidt M,et al.High-dose propofol triggers short-term neuroprotection and long-term neurodegeneration in primary neuronal cultures from rat embryos[J].J Int Med Res,2009,37（3）：680-8.

　　[5]Benedetti F,Bollettini I,Barberi I,et al.Lithium and gsk3-beta promoter gene variants influence white matter microstructure in bipolar disorder[J].Neuropsychopharmacology,2013,38（2）：313-7.

　　[6]Qu Z S,Li L,Sun X,et al.Glycogen synthase?kinase-3 regulates production of amyloid-beta peptides and tau phosphorylation in diabetic rat brain[J].SciWorldJ,2014,2014:878123.

　　[7]Sofola O,Kerr F,Rogers I,et al.Inhibition of gsk-3 ameliorates abeta pathology in an adult onset drosophila model of Alzheimer′s disease[J].PLoS Genet,2010,6（9）：e1001087.

　　[8]Straiko M M,Young C,Cattano D,et al.Lithium protects against anesthesia-induced developmental neuroapoptosis[J].Anesthesi-ology,2009,110（4）：862-8.

　　[9]Li Y,Wang F,Liu C,et al.JNK pathway may be involved in isoflurane-induced apoptosis in the hippocampi of neonatal rats[J].Neurosci Lett,2013,545:17-22.

　　[10]Liu J R,Baek C,Han X H,et al.Role of glycogen synthase kinase-3 beta in ketamine-induced developmental neuroapoptosis in rats[J].Br J Anaesth,2013,110 Suppl 1:i3-9.

　　[11]Soriano S G,Liu Q,Li J,et al.Ketamine activates cell cycle signaling and apoptosis in the neonatal rat brain[J].Anesthesiology,2010,112（5）：1155-63.

　　[12]唐倩倩，郭小云，劉迪，等。GSK-3β參與神經(jīng)精神疾病的研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報，2014,30（9）：1193-6.

　　[13]Marmol F.Lithium:bipolar disorder and neurodegenerative diseases possible cellular mechanisms of the therapeutic effects of lithium[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2008,32（8）：1761-71.

　　[14]鄒艷平，栗艷芳。鋰劑抑制新生鼠缺氧缺血后的細胞凋亡及炎癥反應研究[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2013,16（6）：1-5